Diferenta intre secventierea Sanger si Pyrosequencing | Sanger Sequencing vs Pyrosequencing

Diferența cheie - Sequencingul Sanger vs Pyrosequencing

din aranjamentul corect al nucleotidelor pe o anumită regiune ADN dezvăluie multe informații importante despre el. Există diferite metode de secvențiere a ADN-ului. Secventierea Sanger și Pyrosequencing sunt două metode diferite de secvențiere a ADN utilizate pe scară largă în Biologie Moleculară. Diferența esențială între secvențierea Sanger și Pyrosequencing este aceea că secvențializarea Sanger utilizează dideoxinucleotide pentru a termina sinteza ADN-ului pentru a citi secvența de nucleotide în timp ce piroservenția detectează eliberarea pirofosfatului prin încorporarea nucleotidelor și sintetizând secvența complementară pentru a citi ordinea exactă a secvenţă.

CUPRINS> 1. Prezentare generală și diferență cheie

2. Ce este Sanger Sequencing

3. Ce este Pyrosequencing

4. Comparație între ele - Sanger Sequencing vs. Pyrosequencing

5. Rezumat

Ce este secvența Sanger?

Secvențierea Sanger este o metodă de secvențiere a primei generații a ADN dezvoltată de Frederick Sanger și colegiile sale în 1977. De asemenea, este cunoscută sub numele de

Sequencing Termination of Chain

sau Sequencing Dideoxy terminarea lanțului cu dideoxinucleotide (ddNTPs). Această metodă a fost folosită pe scară largă pentru mai mult de 30 de ani până la dezvoltarea secvenței de generație nouă (NGS). Tehnica de secvențiere a lui Sanger a permis descoperirea ordinii nucleotidice corecte sau atașarea unui fragment ADN special. Se bazează pe încorporarea selectivă a ddNTP și terminarea sintezei ADN în timpul replicării ADN in vitro . Absența grupărilor 3 'OH pentru a continua formarea legăturii fosfodiestere între nucleotidele adiacente este o caracteristică unică a ddNTPs. Prin urmare, odată ce ddNTP este atașat, alungirea lanțurilor încetează și se termină din acest punct. Există patru ddNTP - ddATP, ddCTP, ddGTP și ddTTP - utilizate în secvențierea lui Sanger. Aceste nucleotide opresc procesul de replicare a ADN-ului atunci când sunt încorporate în lanțul de creștere a ADN-ului și au ca rezultat lungimi diferite de ADN scurt. Capsulele de electroforeză se utilizează pentru a organiza aceste mici fire de ADN prin dimensiunile lor pe un gel, așa cum se arată în Figura 01. Figura 1: Electroforeza gelului capilar cu ADN scurt sintetizat Pentru in vitro

replicarea ADN, trebuie furnizate putine cerinte. Acestea sunt enzima ADN polimerază, ADN-ul șablonului, primerii oligonucleotidici și deoxinucleotidele (dNTPs). În secvențierea lui Sanger, replicarea ADN se efectuează în patru tuburi separate, împreună cu patru tipuri de ddNTP separat. Deoxinucleotidele nu sunt în totalitate înlocuite cu ddNTP-urile respective. Un amestec de dNTP special (de exemplu, dATP + ddATP) este inclus în tub și reprodus. Patru produse din tuburi separate sunt executate pe gel într-patru puțuri separate. Apoi citirea gelului, secvența poate fi construită așa cum se arată în figura 02.

Figura 02: Secvențierea Sanger

Secvențierea Sanger este o tehnică importantă care ajută în multe domenii ale biologiei moleculare. Proiectul genomului uman a fost finalizat cu succes cu ajutorul metodelor bazate pe secvențierea lui Sanger. Secvențierea lui Sanger este, de asemenea, utilă în secvențarea țintă a ADN-ului, cercetarea cancerului și a bolilor genetice, analiza expresiei genice, identificarea umană, detecția patogenului, secvențierea microbiană etc. Există mai multe dezavantaje ale secvenței Sanger: secvențiate nu pot fi mai lungi de 1000 perechi de baze

Numai o catenă poate fi secvențializată la un moment dat.

Procesul este consumator de timp și costisitor.

Prin urmare, s-au dezvoltat noi tehnici avansate de secvențiere pentru a depăși aceste probleme. Totuși, secvențializarea lui Sanger este încă utilizată datorită rezultatelor sale foarte precise, până la aproximativ 850 de fragmente de lungime de pereche de bază.

Ce este Pyrosequencing?

• Pyrosequencing este o nouă tehnică de secvențiere a ADN bazată pe "secvențierea prin sinteză". Această tehnică se bazează pe detectarea eliberării pirofosfatului la încorporarea nucleotidelor. Procesul este folosit de patru enzime diferite: polimer ADN, sulfurilază ATP, luciferază și apirază și două substraturi 5 'fosfosulfat de adenozină (APS) și luciferină.
• Procesul începe cu legarea primerului cu șablonul de ADN monocatenar și ADN polimeraza începe încorporarea nucleotidelor complementare acestuia. Atunci când nucleotidele se unesc împreună (polimerizarea acidului nucleic), aceasta eliberează grupurile și energia pirofosfat (două grupări fosfat legate între ele). Fiecare adăugare de nucleotide eliberează cantitatea echimolară de pirofosfat. Pirofosfatul se transformă în ATP prin sulfurilază ATP în prezența substratului APS. ATP generat conduce conversia mediată de luciferază a luciferinei în oxicluferină, producând lumină vizibilă în cantități proporționale cu cantitatea de ATP. Lumina este detectată de un dispozitiv de detectare a fotonilor sau de fotomultiplicator și creează o pirogramă. Apyrase degradează ATP și dNTP neincluse în amestecul de reacție. adăugarea dNTP se face o dată la un moment dat. Deoarece adăugarea de nucleotide este cunoscută în funcție de încorporarea și detectarea luminii, secvența șablonului poate fi determinată.Pyrograma este utilizată pentru generarea secvenței nucleotidice a probei ADN așa cum se arată în Figura 03.
• Piroservenția este foarte importantă în analiza polimorfismului cu un singur nucleotid și în secvențializarea scurtelor întinderi de ADN. Precizia, flexibilitatea, ușurința automatizării și procesarea paralelă sunt avantajele piroservenței asupra tehnicilor de secvențiere Sanger.

Figura 03: Pyrosequencing

Care este diferența dintre secvența Sanger și Pyrosequencing?

- diff Articol Mijloc înainte de Tabel ->

Sanger Sequencing vs Pyrosequencing

Secvențierea Sanger este o metodă de secvențiere a ADN-ului bazată pe încorporarea selectivă a ddNTPs prin ADN polimerază și terminarea lanțului.

Pyrosequencing este o metodă de secvențiere a ADN bazată pe detectarea eliberării pirofosfatului la încorporarea nucleotidelor.

Utilizarea ddNTP

ddNTPs sunt utilizate pentru a termina replicarea ADN

ddNTPs nu sunt utilizate.
Sunt utilizate enzimele implicate	ADN polimerază.
Se folosesc patru enzime: ADN polimeraza, ATP sulfurilaza, Luciferaza si Apyrase.
Substraturile utilizate	APS și Luciferin nu sunt utilizate.
Se utilizează fosfosulfat de 5 'adenozină (APS) și luciferină.
Temperatura maximă	Acesta este un proces lent.
Acesta este un proces rapid.
Rezumat - Sanger Sequencing vs Pyrosequencing	Secventierea Sanger si Pyrosequencing sunt doua metode de secventiere ADN folosite in biologia moleculara. Secvențierea lui Sanger construiește ordinea nucleotidelor în secvență prin terminarea alungirii lanțului în timp ce piroservenția construiește ordinea exactă a nucleotidelor în secvență prin încorporarea nucleotidelor și detectarea eliberării pirofosfatilor. Prin urmare, principala diferență între secvențierea Sanger și Pyrosequencing este că secvențializarea lui Sanger funcționează pe secvențierea prin terminarea lanțului, în timp ce operațiile de piroservenție lucrează la secvențierea prin sinteză.
Referință:
1. Fakruddin, Md și Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing-o alternativă la secvențializarea tradițională a Sanger. "Jurnalul American de Biochimie și Biotehnologie. Publicații Științifice, 02 Mar. 2012. Web. 28 februarie 2017.	2. "Sergentul lui Sanger. "Secvențierea lui Sanger - Subiecte ScienceDirect. N. p., n. d. Web. 28 februarie 2017

Amabilitatea imaginii:

1. "Didesoxy-Methode" de Christoph Goemans (modificat) - Dr. Norman Mauder, pe baza de date Christoph Goemans (CC BY-SA 3. 0) prin Wikimedia Commons

2. "Sanger-ADN-seq" de Enzo la limba poloneză Wikipedia (CC BY-SA 3. 0) prin Wikimedia Commons

3. "Pyrosequencing" prin microbiologie (CC BY-SA 2. 0) prin Flickr